设计好引物后，分别在上下游引物的5’端加上你所需要引入的酶切位点就可以了。如果PCR产物需要酶切，就需要加上保护碱基。不同酶切位点所需要的保护碱基是不一样的，一般参考NEB网站上的一个保护碱基表。一搜就有了。如果不做PCR产物酶切而是直接连接T载体，就可以不加保护碱基，PCR结束后直接加A连T,然后按流程操作就可以了。一般是需要转化-验证-测序，如果是构建表达载体的话还有酶切、连接、验证。
dna合成，新链的延伸方向是5→3
因此，需要在5端加上酶切位点
酶切位点可以上网查
同时，记得再加上一些保护碱基
因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来
保护碱基的具体数目可以上neb的网站查
那么，引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列
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